染色体核型分析主流技术——荧光原位杂交技术

[日期:2010-10-19   作者:方慧云   科室:肿瘤研究所 ]

    荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法,探针首先与某种介导分子结合,杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料。

    FISH的基本原理是将DNA(或RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上,再用与荧光素分子耦联的单克隆抗体与探针分子特异性结合,来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析。FISH具有安全、快速、敏感度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点,不但能显示中期分裂相,还能显示于间期核。同时,在荧光原位杂交基础上又发展了多彩色荧光原位杂交技术和染色质纤维荧光原位杂交技术。

    最早应用荧光原位杂交是在1980年,当时直接用荧光在RNA 3′端标记,作为探针来检测特定DNA序列。联合氨基基质,能够耦联任何半抗原或者荧光团。用简单的化学分析就可以检测低信号探针,这对原位技术的发展很重要。探针的特异性,影响了FISH中低拷贝数量核酸的检测。间接标记杂交探针,可以使非直接检测的信号放大。在20世纪80年代初期,用生物素标记探针,然后用链球菌抗生物素蛋白荧光素级联放大检测DNA。大约10年之后,含有大量荧光分子的杂交探针经化学处理后,可以进行直接检测。20世纪90年代,为同时检测更多的种类,科研工作者开辟了新的研究方向。起初,运用的是成像显著的光谱荧光团。后来,人们开始用两种编码方法来改进它。①特定核酸可以用二元颜色化合物来鉴定。这样,每个染色体、基因或者转录过程就被截然不同的荧光信号所表示。②使用比率相同的编码,用同一种颜色的混合物,依据对全部信号每一种颜色的相对变化,来描绘多种靶目标。采用一种方法和同时用两种一样,已经提高了许多核酸同时检测的数量。

    FISH用不能嵌入体内的荧光团或者仅在杂交时显荧光的探针,来检测活细胞中的RNAs。多元光子方法同样扩大了荧光图像的使用。多光子显微镜,使用近红外线的激发光源能更深的穿透生物样品,并且产生的毒害远小于可见光对活样本的损伤。这种方法可应用到许多方面,包括全部动物。在生物体中使用合成探针的能力有限,所以当前大多数体内荧光图像是自然产生的荧光分子或者生物性发光。在组织中存在的自然荧光信号,是一种生理学或者病理生理学现象,能够编码重要的临床信息。如果能制作与生物最佳结合的探针,那么就可以识别许多特殊的核酸,就可用于非侵入性诊断。FISH作为定位特定核酸序列的检测方法,在过去的20年里不断发展。其初期的发展是扩大探针的种类和靶目标的数量,今后荧光技术的发展是扩展研究学科的种类。由于涉及很多领域,操作容易以及相关学科知识的快速增长,所以FISH的使用非常广泛。虽然基本操作没有改变,但是高敏感检测、多种类检测、自动化数据收集分析技术的提高,很大程度地促进了该技术的发展。它已经成为一项先进的生物学技术。当前,科研人员掌握了低噪声杂交探针的制备,能在更广阔的研究领域中运用它。